崔文艳,罗喜燕,黄 高,李秀雅,彭 玲,何朋杰,2
(1.贵州中医药大学基础医学院,贵阳 550025;2.云南农业大学植物保护学院,昆明 650201)
【研究意义】金银花为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物,具有消炎退肿、清热解毒的功效,临床上常用于治疗流感等病症[1]。近年来,随着金银花药用价值的开发利用,种植面积不断扩大,由忍冬叉丝壳菌(Erysipheloniceraevar.lonicera)引起的金银花白粉病在我国许多金银花产区均有发生流行,尤以大面积种植地区危害严重,且有逐年加重趋势[2]。忍冬叉丝壳菌可侵染金银花的花蕾、叶片和嫩枝等,导致花蕾畸形、叶片脱落等,严重影响金银花的植株生长和产量。一般年份白粉病发病率为5%～15%,严重地块达80%～100%,已经成为无公害中药材种植的大敌,不仅给金银花种植户造成很大损失,而且给金银花产业带来严重威胁[3-5]。目前,生产上种植的金银花品种大多不抗白粉病,喷施化学农药是防治白粉病的主要途径,但是,化学药剂无疑带来环境污染、农药残留和食品安全问题,而且长期使用农药还会使病菌产生抗药性[3,6]。因此,开展金银花白粉病生防内生菌株的筛选及其对金银花白粉病的拮抗作用研究,对提高该病的绿色防治效果,促进金银花产业的发展具有重要意义。【前人研究进展】有关金银花白粉病防治的研究已有文献报道。陈佳斌等[7]研究指出,100.0 mg/L(有效成分,下同) 30%吡唑醚菌酯(SE)、100.0 mg/L 10%苯醚甲环唑(WG)、166.7 mg/L 25%戊唑醇(SE)、83.3 mg/L 25%丙环唑(EC)和125.0 mg/L 250 g/L嘧菌酯(SE)对金银花白粉病均具有较好的防效,在第2次施药后14 d时各药剂的防效依次为91.63%、94.65%、91.67%、91.63%和91.52%。夏永刚等[8]研究指出,20%百菌·烯唑醇复配剂(600倍液)、20%百菌·烯唑醇复配剂(800倍液)、75%百菌清可湿性粉剂(800倍液)、12.5%烯唑醇乳油(800倍液)及70%甲基托布津可湿性粉剂(800倍液)药后7 d的防效,但处理间无显著性差异;药后20 d时以20%百菌·烯唑醇复配剂(600倍液)的防效最好,达88.40%。在可持续农业系统中,施用含生防内生菌株的微生物制剂相较于化学农药具有对环境友好、不易产生抗药性且生产原料广泛等优点,现已广泛用于农作物和中草药病害的防控[9]。其中,芽胞杆菌是一类常见的植物内生菌,其既能高效防控作物病害,又人畜、环境安全无害,是现阶段最理想的生防菌种资源之一[10]。王丽花等[11]研究表明,枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)Y1336的400倍稀释液对月季白粉病的防治效果可达66.93%～80.98%,高于75%百菌清可湿性粉剂500倍液。焦蓉等[12]分离获得的贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)YN201728对烟草白粉病的生防效果可达80%以上。冯争光等[13]研究发现,解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)7T6在施药第7天时,菌液用量为325和650 g/15 kg的处理防效分别为81.22%和88.47%,与43%戊唑醇SC的防效(87.40%)无显著差异,但具明显持效性优势,且能明显改善金银花叶片色泽并促进新梢生长。【本研究切入点】目前,国内外关于金银花病害无公害防治方面的研究较少,尤其是金银花白粉病的生物防治方面的研究更鲜见报道,且尚未发现适宜应用的生产型菌株。【拟解决的关键问题】采用平板对峙、孢子萌发和温室盆栽防效相结合的试验方法从102株金银花内生菌中筛选对金银花白粉病具有应用价值的生防菌株,在此基础上对防效最好的生防菌株进行形态、生理生化和分子鉴定,以期为金银花白粉病的生物防治提供有效的菌种资源,并为该菌在田间条件下的推广应用奠定理论基础。
1.1 材料
1.1.1 供试金银花种苗 金银花白粉病高感的金银花品种“北花一号”种苗购自贵州省安顺市金银花产区。
1.1.2 供试菌株 备选内生细菌:102株金银花内生菌均取自贵州中医药大学中药材病害生物防控课题组菌种库;病原真菌:禾谷镰刀菌(Fusariumgraminearum)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)和玉米小斑病菌(Bipolarismaydis),均由贵州中医药大学中药材病害生物防控课题组保存。金银花白粉病病原物忍冬叉丝壳菌M.lonicera采集自贵州中医药大学中药材大棚内自然发病的新鲜金银花白粉病叶片。
1.1.3 供试试剂 25%嘧菌酯(悬浮剂)购自江西红土地化工有限公司;细菌基因组提取试剂盒购自美基生物科技有限公司(广州);细菌通用引物P0和P6由生工科技有限公司合成(上海);其余试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.1.4 培养基 LB培养基:酵母粉5 g,蛋白胨10 g,氯化钠10 g,琼脂18 g,蒸馏水1 L,pH 7.0,不加琼脂即为液体培养基。PDA培养基:去皮马铃薯200 g,葡萄糖20 g,琼脂18 g,蒸馏水1 L,pH 7.0。
1.2 方法
1.2.1 材料预处理 菌种活化。用PDA培养基活化各病原真菌,用LB培养基分别活化102株备选金银花内生细菌。
分生孢子悬浮液的制备。采集自然发病7～10 d的金银花叶片置于含有12 mg/L的十二烷基磺酸钠的水溶液中轻柔洗涤,用于收集叶片表面的分生孢子。然后置于5000 r/min的条件下室温离心5 min,弃水相收集分生孢子,借助光学显微镜用无菌PBS缓冲液(pH 7.0)重悬白粉病菌的分生孢子至5×104个/mL,现配现用。
1.2.2 拮抗细菌的筛选 参考Cui等[14]的平板对峙法并略作修改。用无菌打孔器(直径5 mm)在已活化好的真菌平板上打孔,将菌块接入新的PDA平板中央,长有菌丝的面向上,28 ℃预培养24 h;用无菌牙签在距离平板中央圆心的水平线上左右各3 cm处分别点接上述102株备选内生细菌。以不接种生防菌株的平板为空白对照,每个处理重复3皿。28 ℃倒置培养5 d,采用十字交叉法分别测量对照和处理组平板中真菌菌落直径(mm),计算抑菌率,用“+++”、“++”、“+”和“-”分别表示抑菌率>50%、26%<抑菌率≤50%、1%<抑菌率≤25%以及无抑菌效果,记录并保存有良好抑菌效果的拮抗菌株。
抑菌率=(1-处理组菌落直径/对照组菌落直径)×100%
1.2.3 孢子萌发试验 孢子萌发试验在水琼脂平板中进行。①将1.2.2中筛选出的12株有较好抑菌效果的拮抗菌株过夜活化后转接至液体LB培养基中,振荡培养72 h后于12 000 r/min的条件下室温离心4 min,弃上清收集菌体,使用等体积的无菌双蒸水重悬菌体,相同条件下再离心1次,弃上清,用无菌PBS缓冲液(pH 7.0)重悬收集的菌体分生孢子至1×107cfu/mL;②配制3%水琼脂培养基,高温灭菌,倒平板前按1∶9的比例加入各拮抗菌菌体悬浮液,倒板后用喉头喷雾器将孢子悬浮液均匀喷洒在平板上,以接种PBS缓冲液为空白对照(CK),3次重复;③25 ℃避光培养24 h,于光学显微镜下观察孢子的萌发情况,测定视野内孢子萌发率,最后计算孢子萌发抑制率。
萌发率=(1-未萌发孢子数/总孢子数)×100%
孢子萌发抑制率=(1-处理组孢子萌发率/对照组孢子萌发率)×100%
1.2.4 盆栽防治试验 试验在昼/夜温度约32 ℃/24 ℃的温室内进行。取2年生的金银花植株移栽入预装有2500 g灭菌土的营养钵(21 cm×21 cm)内。每盆种植3株,每个处理种植10盆。移栽缓苗3 d后,参照李卫利等[15]的方法将孢子悬浮液均匀喷雾接种至健康植株叶片表面,喷雾以叶片上刚刚滴水为适度。选取对白粉病菌分生孢子萌发有较好抑制效果的4株拮抗菌株(HC-7、HC-8、HC-9和HC-12),37 ℃ 160 r/min振荡培养72 h,然后用0.1%吐温20和0.2%黄原胶的水溶液稀释至5×107cfu/mL。待金银花叶片初现白粉病斑后将事先准备的拮抗菌菌悬液喷施接种至叶片表面,直至叶片表面均匀附着1层水膜。然后,采用相同的方法分别在第7和第14天各喷施1次拮抗菌菌悬液。以喷施清水的处理为空白对照(CK1),嘧菌酯25%(悬浮剂)2000倍液为药剂对照(CK2),所有对照组处理方式与生防菌一致。第3次处理7 d后,参考国家田间药效试验准则,分别记录各处理金银花所有叶片的发病程度,计算病情指数与防治效果。金银花白粉病的分级标准按发病程度分为0～9级[16]。0级:叶片无病斑;1级:叶片表面仅见少量病斑,病斑面积占比<5%;3级:病斑面积占比为6%～10%;5级:病斑面积占比为11%～20%;7级:病斑面积占比为21%～40%;9级:病斑面积占比>40%。
病斑面积占比=(病斑面积/整个叶片面积)×100%。
病情指数=[Σ(各级病叶数×相对级数值)×100/(调查总叶数×9)]
防治效果=(空白对照组病情指数-处理组病情指数)/空白对照组病情指数×100%
1.2.5 菌株鉴定 (1)形态及生理生化特征 参照Logan等[17]的方法,对金银花白粉病有显著防效的生防菌株HC-8进行形态和生理生化鉴定,以确定其分类地位。形态学鉴定:将菌株HC-8涂布于LB固体平板表面置于37 ℃恒温培养箱连续培养48 h,观察HC-8菌株在固体LB平板上的菌落形态;然后对HC-8菌株进行革兰氏染色和芽胞染色后借助光学显微镜分析其菌体形态特征、革兰氏染色特性以及能否产生内生芽胞。生理生化鉴定:首先借助紫外分光度检测温度(5、20、30、40、55 ℃)和培养基内氯化钠浓度(1%、2%、5%)对HC-8菌株生长的影响;然后分析HC-8菌株的需氧类型、尿素和柠檬酸盐利用能力、过氧化氢和淀粉水解能力、吲哚乙酸合成能力;最后借助甲基红与V.P试验分析其代谢特性。
(2)分子鉴定 参照He等[10]的方法提取生防菌株HC-8的基因组DNA。以HC-8的基因组DNA为模板,使用2对特异性引物(P0:5′-GAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′,P6:5′-CTACGGCTACCTTGTTAC GA-3′;gyrB-F:5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′,gyrB-R:5′- AGC AGGGTACGGATGTGCGAGCC RTCNACRTCNGCRTC NGTCAT-3′)分别扩增16S rRNA和gyrB基因片段。16S rRNA基因片段的PCR扩增程序如下:94 ℃预变性 4 min 30 s;94 ℃变性40 s,53 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min 20 s,30个循环;最后72 ℃延伸10 min。gyrB基因片段的PCR扩增程序中,除退火温度为60 ℃外,其余与16S rRNA一致。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。将测序所得的拼接结果在线依次输入至GenBank数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)中执行BlastN比对分析。最后,根据比对结果,应用MEGA 7.0以邻接法分别构建系统进化树。
1.4 数据分析
运用SPSS 22.0对试验数据进行单因素方差分析,采用Duncan氏新复极差法做差异显著性检验。
2.1 拮抗菌株筛选
将活化的102株内生细菌通过与禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌及玉米小斑病菌的对峙培养,筛选出具有拮抗作用的内生细菌83株。从表1看出,菌株HC-1～HC-12共12株菌株对3种病原真菌有较高的拮抗活性,其抑制率分别为禾谷镰刀菌23.31%～62.63%,尖孢镰刀菌19.25%～62.63%,玉米小斑病菌16.25%～65.28%。其中,菌株HC-7和HC-9对3株病原真菌均具有较好的抑菌效果,菌株HC-7的抑菌率分别为62.63%、55.87%和62.74%,菌株HC-9的抑制率分别为54.54%、59.21%和61.76%。菌株HC-1、HC-2、HC-8和HC-11菌株对其中2株病原真菌有较好的抑菌效果,菌株HC-1、HC-2和HC-8对尖孢镰刀菌和玉米小斑病菌抑制作用较强,其对尖孢镰刀菌和玉米小斑病菌的抑菌率分别为51.16%和65.28%、50.81%和63.23%、51.92%和51.34%;菌株HC-11展现出良好的拮抗禾谷镰刀菌和玉米小斑病菌的效果,其抑菌率分别为52.04%和53.91%。
表1 内生菌对3种病原真菌的抑制率
2.2 不同拮抗菌株处理白粉病菌分生孢子的萌发率和抑制率
从表2看出,处理24 h后,空白对照(PBS缓冲液处理)金银花白粉病菌分生孢子的萌发率为61.86%,各拮抗菌株(HC-1～HC-12)处理的孢子萌发率仅为15.66%～28.55%,其中,菌株HC-10的孢子萌发率最高,显著高于菌株HC-7、HC-8、HC-9和HC-12;菌株HC-1其次,为26.48%,显著高于菌株HC-9和HC-12;菌株HC-12最低;12株拮抗细菌处理的孢子萌发率均显著低于空白对照。不同拮抗菌株对白粉病菌分生孢子萌发的抑制率为54.10%～74.71%,其中,菌株HC-12的抑制率最高,菌株HC-9其次,为73.91%,二者与除菌株HC-7(69.46%)和HC-8(71.01%)外的其余拮抗菌株处理间差异显著;菌株HC-10的抑制率最低,抑制效果显著低于除菌株HC-1(57.09%)和HC-5(58.90%)外的其余菌株处理。
表2 不同拮抗菌株处理白粉病菌分生孢子的萌发率和抑制率
2.3 不同拮抗菌株处理白粉病的病情指数与防治效果
从表3看出,只接种病原孢子的空白对照(CK1)发病较为严重,病情指数高达65.2,显著高于各菌株处理和喷施25%嘧菌酯2000倍液(CK2)处理。喷施25%嘧菌酯2000倍液(CK2)7 d后,病害的病情指数为12.84,显著低于各菌株处理,其防治效果为80.3%,显著高于各菌株处理,有效地减轻了白粉病的危害。叶面喷施拮抗菌株HC-7、HC-8、HC-9和HC-12发酵液稀释液(5×107cfu/mL)后,各处理的病情指数分别为23.9、18.3、43.4和35.4,均显著低于CK1,且各处理间差异显著;各处理的防治效果为33.4%～71.9%,其中,喷施接种菌株HC-8后防效最佳,金银花白粉病病情指数较CK下降46.9,防治效果为71.9%,与CK2接近,显著高于菌株HC-7(63.3%)、HC-9(33.4%)和HC-12(45.8%)处理,各处理间差异显著。
表3 不同拮抗菌株处理金银花白粉病的病情指数和防治效果
2.4 拮抗菌株HC-8的鉴定
2.4.1 形态特征 从图1看出,菌株HC-8涂布于LB固体平板表面置于37 ℃恒温培养箱连续培养48 h后,培养初期菌落呈乳黄色,圆形或椭圆形,边缘不规则;培养后期菌落表面干燥有皱褶。光学显微镜下观察,菌体呈杆状,产芽胞,革兰氏染色呈阳性。此形态特征与贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)一致。
a:LB平板上菌落形态;b:革兰氏染色;c:芽胞染色。
2.4.2 生理生化特征 试验结果表明,HC-8菌株在20、30、40 ℃下能正常生长,对应OD600值分别为1.628、2.339和2.216,随温度升高OD600值呈先升后降趋势;在5和55 ℃不能正常生长,对应OD600值均低于0.1;在浓度1%、2%和5%氯化钠溶液中(37 ℃)均能正常生长,对应OD600值分别为2.805、2.474和1.569,随氯化钠溶液浓度升高,OD600值呈下降趋势。此外,HC-8菌株的生理生化特征还表现为兼性厌氧,不分解尿素;产吲哚乙酸、柠檬酸盐利用、过氧化氢、淀粉水解、明胶液化、甲基红及V.P等试验均为阳性。此生理生化特性与贝莱斯芽胞杆菌(B.velezensis)相近。
2.4.3 分子鉴定 借助DNAMAN软件将菌株HC-8的测序结果进行拼接,结果显示,经PCR扩增获得的16S rRNA和gryB基因片段序列长度分别为1427和1209 bp。将拼接的2段序列依次输入NCBI进行BLAST同源性比对的结果显示,均与贝莱斯芽胞杆菌的同源性为99%。根据BLAST比对结果,选取同源性较高的菌株序列,借助MEGA用邻接法构建系统进化树(图2),16S rRNA和gryB基因序列的聚类分析结果表明,菌株HC-8与菌株B.velezensisJE3和B.velezensisW1的遗传距离最小,聚为一类。综合形态、生理生化及分子鉴定结果,确定菌株HC-8为贝莱斯芽胞杆菌(B.velezensis)。
图2 菌株HC-8基于16S rRNA(a) 和gyrB(b)基因序列的系统发育树
金银花在引种栽培过程中,遭受到各种病虫害的危害,直接影响其产量和质量。近年来,白粉病已成为制约金银花等药用植物高产和品质提升的主要病害之一[3]。为了防控白粉病,生产上长期、过量施用化学农药,导致严重的农药残留,进而影响中药材的品质,也不符合绿色中药材产业发展的需求,亟需寻找化学防治的替代方法[5-6]。白粉病的病原菌为子囊菌,本研究所用的3种指示菌均为半知菌,但由于大部分半知菌为子囊菌的分生孢子阶段,细胞壁的主要成分相同,主要为几丁质和β-葡聚糖[18],所以选择此3种病原菌作为指示菌用于平板对峙试验。本研究通过平板对峙试验和孢子萌发抑制试验获得的12株拮抗菌株对3种指示菌的生长和白粉菌分生孢子都具有良好的抑制效果,证明筛选方法有效,在一定程度上能克服白粉病病原菌不可培养所带来的无法做抑菌试验的问题。Jiao等[19]研究能高效防控烟草白粉病的贝莱斯芽胞杆菌YN201732的生物学特性后发现,其对镰刀菌属病原真菌的拮抗效果显著高于其他属病原真菌,本研究结果与之一致。对3种指示菌抑制效果最佳的菌株是HC-7,而对白粉菌分生孢子萌发抑制作用最强的菌株是HC-9,推测可能与白粉病病原菌与半知菌细胞壁的成分并非完全相同有关[20];同时表明,平板对峙结果只能作为一种参考。盆栽条件下,接种HC-8菌株后防治效果显著高于HC-7、HC-9和HC-12等拮抗菌株。Des等[21]研究发现,生防细菌在不同环境和生理条件下定殖能力差异较大,进而导致其生防效果出现较大的波动。此外,生防细菌在室内环境和自然环境中的适应和存活能力也存在显著差异[8,22],此原因可能是导致本盆栽试验结果与室内拮抗试验结果不完全一致的原因。此外,考虑到田间自然环境下光照、风力、温度、湿度和pH等的不同,本研究筛选的贝莱斯芽胞杆菌HC-8在大田环境中对金银花白粉病的防控效果还有待进一步研究。
贝莱斯芽胞杆菌是芽胞杆菌属中最重要的成员之一,因具有抗逆性强、防治效果好、对人畜安全无害且制剂稳定性高的特点而被广泛开发应用于农业和中药材产业的植保领域,能有效防控多种田间常见植物病害[9-10]。贝莱斯芽胞杆菌主要通过产生拮抗物质(如脂肽类抗生素)、营养和生态位点竞争、溶菌作用及诱导系统抗性等机制帮助植物对抗病原真菌[23-24]。HC-8菌株防控金银花白粉病的生防机制尚不明确,后期将开展深入研究,以期为HC-8菌株开发为高效生防制剂,促进金银花产业的健康发展提供理论依据。
本研究从菌种库内102株金银花内生菌中筛选得到12株对禾谷镰刀菌、尖孢镰刀菌和玉米小斑病菌等3种植物病原真菌拮抗效果较好的菌株,其中,菌株HC-1、HC-2、HC-7、HC-8、HC-9及HC-11共6株拮抗菌株对至少2种病原真菌有较好的抑菌效果。室内离体分生孢子萌发试验显示,12株拮抗菌均能显著抑制白粉菌分生孢子的萌发,其中,菌株HC-7、HC-8、HC-9和HC-12共4株拮抗菌株对白粉分生孢子的萌发有较强抑制作用,处理24 h后金银花白粉病菌的分生孢子萌发率分别为18.90%、17.93%、16.09%和15.66%,孢子萌发抑制率分别为69.46%、71.01%、73.91%和74.71%。温室盆栽喷施菌株HC-8菌液后,金银花白粉病病情指数下降46.9,防治效果为71.9%,显著优于HC-7(63.33%)、HC-9(33.36%)和HC-12(45.78%),且与25%嘧菌酯悬浮液(80.3%)相近。HC-8菌株经过形态、生理生化和分子手段鉴定为贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)。生防内生菌株在金银花白粉病绿色防控上有巨大的应用潜力。
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